如何確定光譜信號就是所標(biāo)記探針的信號
熒光成像已經(jīng)被用到基因、細胞和活體的研究中來，而在活體情況下所面臨的挑戰(zhàn)*多。

　　1.自發(fā)熒光的可變性。a在不同激發(fā)光條件下，自發(fā)熒光會有明顯不同；b動物身體的不同部位會有不同的自發(fā)熒光；c同一只動物在不同時間自發(fā)熒光的波譜和強度也可以不同；d不同小鼠的自發(fā)熒光在波譜和強度上也有差別；e有時會受到飼料的影響濕度傳感器探頭, 不銹鋼電熱管, PT100傳感器, 流體電磁閥,鑄鋁加熱器,加熱圈。

　　2.所用探針的發(fā)射波長較長。用于基因和細胞水平熒光探針或熒光蛋白發(fā)射波長通常在600nm以下，而活體研究*佳的發(fā)射波長范圍在600-900nm之間。

　　3.受探針濃度的影響。熒光探針通常通過尾靜脈打入體內(nèi)，探針會被動物的血液和組織稀釋，如果沒有明顯的靶向，在活體內(nèi)信號會比較弱，因此探針的靶向性一定要明確，如果沒有靶向性，在活體條件下尋找探針的特征光譜會非常難。

　　4.受位置的影響。如果探針靶向的部位距體表較遠，一方面激發(fā)光的射入會減少，同時發(fā)射光也會被組織吸收，位置越深，減少越多。因此如果靶向的部位較深，一定要保證探針的濃度使發(fā)光足夠強，同時盡量選用發(fā)射波長較長的探針。

　　5.合成的探針在活體條件下容易發(fā)生變化。用化學(xué)或生物的方法合成探針通常在較純的溶劑中發(fā)生反應(yīng)，但是活體條件下，動物的血液、組織液成分復(fù)雜，親水或疏水性質(zhì)難以預(yù)測，網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)大量存在，在體外表現(xiàn)很好的探針也有可能在體內(nèi)發(fā)生復(fù)雜的變化，導(dǎo)致探針發(fā)生結(jié)構(gòu)改變或脫落，從而發(fā)射波譜也會發(fā)生未知的改變。

　　活體熒光成像面臨著多方面的挑戰(zhàn)，如何才能做到準確無誤的尋找到所要的波譜，進而進行合適的光譜分離呢？以下是一些做體內(nèi)熒光成像的一些建議：

　　1.探針體外表現(xiàn)穩(wěn)定可靠。探針合成之后必須要在打入體內(nèi)之前進行成像，確定發(fā)射波譜和強度，需要考察不同批次探針之間是否存在差異，是否有淬滅現(xiàn)象，如果可能的話，用血液等生物體液溶解探針觀察是否存在變化。另外在體外觀察探針時，也一定要用溶劑做對照。

　　2.要確定靶向性。也就是說要有陽性對照，比如說要做腫瘤的早期診斷，盡量參考前人研究先用確定能夠靶向的分子作為陽性對照，這樣打入體內(nèi)后，確定能夠在腫瘤位置找到探針的波譜，如此確定之后，找到適合體內(nèi)光譜分離的拆分條件，用于之后的進一步實驗。

　　3.活體成像時一定要有對照。也就是說有陰性對照組，比如通過陽性對照組確定波譜之后，以此光譜分離的拆分條件對陰性對照組進行拆分，如果條件合適的話，陰性對照組應(yīng)該是沒有相應(yīng)信號的。如此，再比較拆分條件中探針的發(fā)射波長和體外觀察時的發(fā)射波長，如果兩者比較接近，那么就能夠肯定所尋找的探針波譜就是所考察的信號。